泛素蛋白酶体通路及其与动脉粥样硬化斑块关联研究进展

         摘要泛素蛋白酶体系统( UPS)是细胞内非溶酶体途径蛋白降解通路，在生物体内负责大多数细胞周期过程中蛋 白降解及异常蛋白降解，可维持蛋白质稳定状态、调节细胞程序性死亡、控制细胞周期、条件信号转导通路、介导受体内吞、I型抗原加工呈递和炎症反应等。当前相关研究显示，泛素蛋白酶体通路通过炎症机制促进动脉粥 样硬化相关疾病的发生发展。
         故本文就UPS的组成及其在动脉粥样硬化发生发展中作用的新进展、前景做一综述。 
         关键词泛素蛋白酶体通路：动脉粥样硬化机制 
         泛素蛋白酶体系统( UPS)是真核生物细胞内高度保守的 多肽，是三磷酸腺苷( ATP)依赖性的，细胞内非溶酶体途径蛋白降解通路，在生物体内负责大多数细胞周期过程中的蛋白降解，包括凋亡，基因转录，细胞信号通路和溶酶体消化过程等。同时，UPS可降解异常蛋白，如未折叠蛋白，受损蛋白，变异及错误转录蛋白，故UPS对于维持细胞正常功 能发挥着重要作用。先前研究显示UPS能促进心血管疾病发展。本文简短综述当前关于泛素蛋白酶体结构和功能的研究，阐述泛素蛋白酶在动脉粥样硬化进程中发挥的作用。 
         1泛素蛋白酶体结构及功能 泛素是广泛分布在真核细胞中的小分子球状蛋白质体 系，为高度保守结构，占细胞蛋白总量的近l%二单个泛素 分子由76个氨基酸组成，分子量8.5 KD-泛素分子折叠为 球形，由5个B层形成一个腔，内部a螺旋为对角线结构， 为泛素折叠、这个蛋白质含有明显疏水核心和大量氢键，故 可维持泛素结构稳定性，防止在结合和降解过程中变性失活。 
         泛素是由76个氨基酸组成的高度保守多肽，广泛分布于各类 细胞，与基质蛋白酶相关。分子量为8.45 KD，是一种非常小的球形蛋白，也是能量依赖性的泛素蛋白酶体的重要组分，常与其他蛋白质共价结合发挥生物学作用：泛素广泛存在于所有真核组织细胞中，序列相当保守，其氨基酸序列从 昆虫到人类基本相同。 泛素体系主要由泛素、泛素激活酶( E1)、泛素缀合酶( E2)、泛素连接酶(E3)及26S蛋白酶体组成，其活性中心 在26S蛋白酶体中。泛素降解细胞内蛋白质的简要过程如下：泛素被E1激活并连接到其半胱氨酸残基上，然后通过转酰基作用进一步转移到E2的半胱氨酸残基上。泛素可以直接 从E2转移给底物蛋白形成泛素一蛋白复合物，或与E3蛋白复合物结合，多个泛素单元可形成多聚泛素链。E4(UFD)与E3蛋白复合物结合，多个泛素单元可形成多聚泛素链。 E4作用可能是与较短的泛素链结合促进长泛素链的形成。泛素一蛋白复合物主要被26S蛋白酶识别降解，同时由泛素C端水解酶释放泛素再循环利用。 E1:为泛素与底物蛋白结合的个酶，通过其活性位点的半胱氨酸残基与泛素的C末端形成高能硫酯键而激活泛素，是细胞活性和生存所必须的酶。泛素缀合酶E2:为小分子蛋白质，核心区域内含有活性所需的半胱氨酸残基， 可催化泛素与底物蛋白之间形成异肽键。E2介导的是泛素分 子经过转硫醇反应从E2半胱氨酸残基转移给E2活化的半胱 氨酸位点。E2同时与E1及E3S连接，主要发挥转运泛素分子到靶蛋白上的作用。泛素连接酶E3:E3决定底物的选 择，可催化泛素与底物结合，目前主要有3种类型E3s:含有HECT结构域的E3s，含有环指状结构域或患有U-box结构域的E3s。E4: -种能通过与较短的泛素链结合，而促进长泛素链形成的蛋白质。 26S蛋白酶体：是降解泛素化底物的一个ATP依赖型蛋白水解复合体，由20S核心蛋白酶(CP)和19S调节颗粒(RP)结构组成，主要作用是将胞质内蛋白质裂解为短肽片段， 此酶体功能可被蛋白酶体抑制剂抑制。20S蛋白酶体含有类 糜蛋白酶活性、类胰蛋白酶活性、谷氨酰水解酶活性、支链 氨基酸肽酶活性、中性氨基酸切割活性等多种活性，可介导 靶蛋白的水解。 泛素再循环酶：包括泛素C一末端水解酶( UCHs)、同工 肽酶、去泛素化酶多种酶，能通过水解多聚泛素链和促进泛 素形成以维持游离泛素的浓度，同时可以调整错误标记的泛素，使其去泛素化，同时可将多聚泛素链从26S蛋白酶上分 离以保证识别准确度。
          2泛素蛋白酶体降解蛋白的步骤 多个泛素被激活、转运，分别通过El、E2、E3连接于 靶蛋白上，形成多聚泛素链，然后多聚泛素链标签的靶蛋白被26S蛋白酶体复合物识别和降解。 
         具体步骤如下：第 一步：E1、E2、E3共同作用下，将泛肽C端羧基与底物蛋白氨酸残基￡氨基形成异肽键，后续泛肽以类似方式连接成串，完成底物蛋白多肽化标记。第二步：26S蛋白酶体两 端的19S调节亚基识别、结合泛素的底物蛋白，在26S蛋白酶体催化核心20S亚基的催化作用下，将蛋白酶水解为多肽， 继而多聚泛素链在泛素再循环酶作用下释放出泛素以供重新 利用，形成泛素的再循环途径。归纳起来，就是：步，底物识别，识别底物的特殊降解信号；第二步，泛素与底物的共价连接，在ATP提供能量的同时，将多个泛素连接到底 物上形成多聚泛素链；第三步，降解底物蛋白，释放出游离泛素。 
         3泛素蛋白酶体的功能及与动脉粥样硬化关联 UPS的功能：对于细胞的生理功能方面起着非常重要的 作用，UPS为细胞内蛋白质降解的主要途径，UPS的功能状态对于细胞的存活来说具有决定性作用，可通过泛素连接酶 MDM-2抑制细胞凋亡转录因子p53的生理活性，下调细 胞周期抑制因子如周期素依赖激酶受体p21的表达，从而减少促细胞凋亡因子Bax的表达，故在炎症、增殖和细胞凋亡等细胞重要病理生理过程中也可发挥重要作用。 UPS与动脉粥样硬化关联：动脉粥样硬化是一种慢性炎症病理过程，是在多种损伤危险因素作用下导致的炎症反应。 损伤性刺激可在内源性氧化应激作用下加剧，通过脂质、蛋白质、DNA的氧化修饰而引起血管壁结构功能的改变。泛素 蛋白酶体广泛降解异常及短命的蛋白质，调节机体稳态，参 与动脉粥样硬化多种病因学说的致病过程。动脉粥样硬化是由损伤刺激对动脉壁造成的炎症增殖反应所致，核因子-kB( NF-kB)在核因子KB抑制蛋白(lkB)参与下介导动脉粥样 硬化一增殖反应。从病理病变进展角度，动脉粥样硬化分为 脂纹期、进展期，于动脉粥样硬化病变早期脂纹期，冠状动 脉壁有大量泛素化蛋白聚集，蛋白体活性增强，于动脉粥样 硬化进展期，损伤部位炎症细胞浸润，纤维斑块形成。
         血管 平滑肌细胞从收缩型向增殖型转化。而这些动脉粥样硬化斑块内膜基底部，泛素蛋白酶相关蛋白表达上调，导致斑块不稳定性增强，导致心血管事件发生概率增加。同时UPS还在巨噬细胞、泡沫细胞聚集方面发挥作用，可通过聚集的低密 度脂蛋白诱导泛素蛋白表达增多，以降解低密度脂蛋白，促进细胞凋亡。故泛素蛋白酶与动脉粥样硬化的发病过程及进 展病理过程密切相关。 动脉粥样硬化是损伤性刺激启动的炎性增殖反应。内皮细胞可产生NO，通过提高NF-kB的活性以拮抗动脉粥样硬化启动。
         研究表明，抑制UPS能上调NO合酶表达，促进 NO合成。在严重氧化应激情况下，UPS在NF-kB的激活中起了关键作用。 血管平滑肌细胞增殖性病变是动脉粥样硬化发展阶段的 主要特征。UPS可促进血管平滑肌细胞发生功能性改变，使 其收缩功能降低。UPS可促进损伤区域新生血管内膜形成，导致细胞凋亡增加。 不稳定性斑块具有纤维帽薄、脂质核心大、胶原产物 少、胶原降解增加，与炎性细胞浸润、血管细胞凋亡有关。 T细胞是动脉粥样硬化的特征性炎症成分，与斑块进展和破 裂相关。T细胞激活增加UPS特性，增加肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素一l（IL-1）释放，导致血管平滑肌细胞凋亡。炎性细胞因子增加了血管平滑肌细胞表面死亡受 体Fas-CD95表达，启动外源性细胞凋亡途径。另一方面， UPS可降解短寿命促凋亡蛋白p52、Bax、p27，而在不稳定 的动脉粥样硬化斑块中，由于氧化低密度脂蛋白( ox-LDL)作 用，导致UPS功能损伤而使促凋亡蛋白增多，使细胞周期停滞并凋亡。故UPS与不稳定动脉粥样硬化斑块的形成与发展相关。 UPS可通过调节炎症反应在动脉粥样硬化进展过程中发挥作用：转录因子NF-kB是许多因素促进动脉粥样硬化发生发展的共同通路，低密度脂蛋白( IDI)、血管紧张素II
（Angll）、长期高血糖、巨噬细胞、肺炎衣原体感染等都可 以激活NF-kB，使下游的IL-1和细胞间黏附分子（ICAM-1） 增加，启动炎症反应，促进动脉粥样硬化发生。NF-kB的生物学效应受到IkB的抑制，IkB在被26S降解的过程中释放NF-kB启动转录；蛋白酶体抑制剂MG132处理可抑制IkB的 降解，从而抑制其激活和转录。由此可见，蛋白酶抑制剂可 能上调IkB，阻断NF-kB的激活及下游的炎症反应。 泛素蛋白酶体可通过调节细胞凋亡、脂质代谢、氧化损伤影响动脉粥样硬化进程：对细胞凋亡的影响：巨噬细胞脂蛋白诱导基因的mRNA明显增高，这种细胞一般经LDL处 理，导致细胞凋亡减少，泡沫化细胞增多。研究报道该蛋白类编码蛋白与泛素结合酶中一款蛋白同源，加入蛋白酶抑制 剂处理则可抑制该蛋白表达，提示泛素蛋白酶体通路可能在 巨噬细胞凋亡、泡沫细胞形成中发挥作用。泛素蛋白酶体对脂质代谢的影响：泛素蛋白酶体及蛋白酶体抑制剂可共同调节载脂蛋白影响脂质代谢。载脂蛋白A( apoA)主要存在于 血浆LDL中，可受蛋白酶体抑制剂乳胱素和蛋白酶体抑制剂ALLN调控，以抑制apoA降解并促进它与脂质的结合及分泌，增加血浆apoA的水平。蛋白酶体抑制剂ALLN及MG132都 可延长细胞内LDL受体相关蛋白类的的半衰期，增加其在细胞表面的表达，从而促进脂质清除，降低粥样斑块形成。 ApoB可组装乳糜微粒及LDL，从而发挥调节LDL清除的作用。 
         蛋白酶体抑制剂可能抑制泛素化的apoB降解，上调apoB的 表达。ApoE与动脉粥样硬化敏感性相关，泛素蛋白酶体可降解apoE，而蛋白酶体抑制剂如乳胱素可导致apoE聚集，降解速率减慢。泛素蛋白酶体与氧化损伤：氧化损伤可促使细 胞可产生有害物质，如NF-kB，若给予蛋白酶体抑制剂可抑 制NF-kB活性。 除上述途径外，泛素蛋白酶体还可以通过其他机制调 节动脉粥样硬化。用蛋白酶体抑制剂MG132处理牛肺动脉内皮细胞及人脐静脉内皮细胞( HUVEC)，内皮型eNOS的 mRNA及蛋白质表达呈剂量依赖性增加。将大鼠颈总动脉组织环和MG132共同培养，组织环呈内皮细胞源性NO依赖式舒张，提示蛋白酶体抑制剂可能通过促进eNOS的产生延缓血管重塑。 Versari等对于患者动脉硬化斑块进行了泛素的检测，结果显示，在动脉粥样硬化斑块中，当泛素蛋白酶的活性受到抑制时，氧化应激反应加剧，该反应尤其存在于有临床症 状的患者中。故提示泛素蛋白酶与斑块稳定性具有关联。提示泛素是动脉粥样硬化过程的保护因素，可以通过降解氧化的及受损伤蛋白而抑制动脉粥样硬化进程。
         同时有报道称在感染艾滋病患者中应用蛋白酶抑制剂，可提高其动脉粥样硬化的发病机率。 Sozen等研究显示，泛素蛋白酶可通过c-Jun氨基末 端激酶一1( JNK-I)磷酸化作用及蛋白激酶一1(AP-1)的作用而调节基质金属蛋白酶( MMP)的表达，从而减少动脉粥样 硬化的进程。同时，相关研究显示，高密度脂蛋白( HDL)在 动脉粥样硬化中的保护作用是通过P2Y13受体的作用而完成 的，而泛素在该受体的表达调节中发挥了重要作用。 泛素抑制剂的相关研究也显示了泛素蛋白酶在动脉粥样硬化方面发挥的作用。通过泛素抑制剂沉默动脉粥样硬化中NF-kB通路已在细胞实验及动物模型试验方面显示了其对于 相关疾病的治疗前景。当前许多新的研究关注方向不只将泛 素蛋白酶抑制剂仅仅作为一种炎症抑制因子，且将其作为潜在的药物治疗方法。 因此，关于泛素蛋白酶和其抑制剂的研究将会为心血管疾病的治疗提供新思路。 综上所述，泛素蛋白酶体是细胞内ATP以来的蛋白质选择性降解的主要途径，是真核细胞内重要蛋白质调节系统， 除了参与细胞内正常生理过程调控外，在动脉粥样硬化发病进程中也发挥重要作用。随着科学技术的发展，泛素蛋白酶体途径会进一步显明，从而促进人们对于泛素蛋白酶体的认 识和对于动脉粥样硬化机制的进一步理解，从而对于疾病防治有着进一步指导作用。 
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        （收稿日期：2015-01-28） ． （编辑：常文静）