慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T细胞亚群变化与其血清HBVDNA的水平分析

　作者：王辉1,高建鹏1,游晶2　　作者单位：1.昆明市延安医院，云南 昆明 650051;2.昆明医学院附属医院，云南 昆明 650032

　　【摘要】目的：观察慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染者细胞免疫功能的变化，探讨病毒复制程度与细胞免疫功能的关系。方法：应用流式细胞仪直接免疫荧光法检测136 例乙肝病毒感染者、60 例正常对照者外周血T淋巴细胞亚群百分率，用荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测乙型肝炎感染者血清HBV DNA。结果：84 例慢性HBV携带者(ASC)、52 例慢性乙型肝炎(CHB)患者与健康对照组相比，CD3+T淋巴细胞百分比、CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均显著降低(P<0.001)，CD8+T淋巴细胞百分比均显著升高(P<0.001)。慢性乙型肝炎患者与慢性HBV携带者相比，CD3+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P>0.05)、CD4+T淋巴细胞百分比明显降低(P<0.05)、CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P=0.01)、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值明显降低(P<0.05)。随着病情发展，从健康对照组、慢性HBV携带者到慢性乙型肝炎，CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值呈逐渐下降趋势，CD8+T细胞百分比呈逐渐升高的趋势。慢性HBV携带者HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组相比，CD3+T淋巴细胞差异均无统计学意义(P>0.05)，CD4+T淋巴细胞百分比明显下降(P<0.001)，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值明显下降(P<0.001)，CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P<0.01)。结论：HBV感染可导致感染者细胞免疫功能的改变，HBA DNA复制增加进一步加重乙肝病毒感染者T细胞亚群的紊乱，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值的动态变化可及时提示临床HBV感染者细胞免疫功能的变化并加强临床的监测。
　　【关键词】 慢性乙肝病毒感染者;T细胞亚群;HBV DNA

　　Abstract ob[x]jective：To investigate the significance relation ofserum heptatitis B virus(HBV) DNA levels and cellular immunity in chronic heptatitis B virus infection.Methods：Peripheral T-cell subsets were examined in 136chronic heptatitis B-virus and 60 health control，and HBV DNA in heptatitis Bvirus was examined by realtime fluores-cence quantitative polymerase chain reac　　tion.Results：In comparison with those in health controls，the rates of CD3+T，CD4+T lymphocyte cells and CD4+T/CD8+T were significantly reduced(P<0.001).and the rates of CD8+T lymphocyte cells was obvious increased(P<0.001)in 84 asymptomatic chronic HBV carriers(ASC) and 52 patients with chronic heptatitis B-virus(CHB) respectively.The rates of CD4+T lymphocyte cellsand CD4+T/CD8+T were obvious lower(P<0.05)，and the rates of CD8+T lymphocyte cells was obvious higher(P=0.01) in CHB patients than those inASC patients，but there was no statistically difference for CD3+T lymphocytecells between them.There was a trend of decreasing the rates of CD4+T cellsand CD4+/CD8+ and a trend of increasing of the rate of CD8+T cells in t　　he order of health control and ASC and CHB.The rates of CD3+T lymphocyte cells in ASC patients in HBV DNA positive group showed no significant differences from those of HBVDNA negative group(P>0.05).The rates of CD4+T lymphocytecell，CD4+/CD8+ were significantly lower(P<0.001)，CD8+T lymphocyte cell was significantly higher(P<0.01) in HBV DNA positive group as compared with HBV DNA negative group.Conclusion：Chronic HBV infection can lead to dis　　order of cellular immunity，and disorder can be promoted by the increased serumlevels of HBV DNA.The dynamic changes of CD4+/CD8+ can indicate the changeable cellular immune functions of HBV infections and improve the clinical inspections.

　　Key words hepatitis B virus;T-cell subsets;HBV DNA

　　我国乙型肝炎病毒(HBV)感染率约为人口比例一半以上，HBV携带率为9.75%，其中近20%～30%的携带者可能终发展为慢性肝炎和肝硬化，HBV感染严重危害人们的身体健康。乙肝病毒激活机体的免疫效应主要是T淋巴细胞，包括特异性的CD8+细胞毒性细胞(CTL)和CD4+辅助性细胞(Th)及激活的淋巴单核细胞释放的多种炎症细胞因子。CD4+T细胞通过识别抗原提呈细胞上加工的HBV病毒肽和MHC-Ⅱ类分子复合物结合而活化。活化的CD4+T细胞辅助B细胞产生抗体及诱导CTL活化，同时能增强CD8+效应T细胞的过程[1]。乙型肝炎的发生、发展与宿主的细胞免疫功能状态密切相关，T细胞亚群的调节紊乱是HBV在体内持续复制的主要原因[2]。本文采用直接免疫荧光法通过流式细胞仪检测HBV感染者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+，CD4+，CD8+)及血清中HBV DNA载量水平，来评价HBV感染后细胞免疫功能的变化及其与血清HBV DNA水平的关系，为临床工作提供参考。现报告如下。
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　1.1.1 慢性HBV携带者组

　　84 例慢性HBV携带者(ASC)均为门诊患者，其中男45 例，女39 例，均为汉族，年龄16～52岁。诊断符合2010年中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准[3]。
　　1.1.2 慢性乙型肝炎组

　　52 例慢性乙型肝炎(CHB)患者均为门诊患者，其中男35 例，女17 例，均为汉族，年龄21～54 岁。诊断符合2010年中华医学会肝病学分会中华医学会感染病学分会联合制订的《慢性乙型肝炎防治指南》中的诊断标准[3]。
　　1.1.3 健康对照组
　　选择性别、年龄均与上述两组匹配的健康人员60 例，并列入健康对照组，其中男36 例，女24 例，均为汉族，年龄16～56 岁。
　　1.2 研究方法

　　1.2.1 HBV血清标志物的检测
　　血清标志物包括乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎表面抗体(HBsAb)、乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙型肝炎病毒e抗体(HBeAb)、乙型肝炎核心抗体(HBcAb)等检测，采用上海华美生物工程公司生产的试剂盒，以酶联免疫吸附法(ELISA法)进行检测(用奥地利生产的ANTHOS2010型酶标仪)。严格按照使用说明操作。
　　1.2.2 肝功能检测
　　采用日本AU2700全自动生化分析仪进行检测。
　　1.2.3 HBV DNA定量检测
　　采用杭州博日科技有限公司生产的BIOER荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测系统(FQD-33A型)。HBV PCR荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程公司。严格按照使用说明操作。HBV DNA阴性值为<1.0×103 copies/mL。
　　1.2.4 T细胞亚群检测
　　取全血100 μL(EDTA抗凝或肝素抗凝)加入20 μL三色单克隆抗体(CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE，由Immunotech公司提供)，混匀，室温避光放置20 min。放入Muti-Q-Prep处理仪处理(由美国Coulter公司提供)后，用流式细胞仪(EPICS-XL，由美国Coulter公司提供)　　检测T细胞亚群。健康对照组取100 μL全血加入20 μL小鼠IgG-PE-CY5/IgG-FITC/IgG-PE(由IMMUNOTECH公司提供)，其余步骤同上。
　　1.3 统计学方法
　　用SPSS for Windows 11.5统计软件包对实验数据进行分析。计量资料用t检验或方差分　析，计数资料用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结 果
　　2.1 慢性HBV感染者与健康对照组比较外周血T淋巴细胞亚群检测结果
　　(见表1)慢性HBV携带者、慢性乙型肝炎患者与健康对照组相比，CD3+T淋巴细胞百分比(P=　　0.000，P=0.000)，CD4+T淋巴细胞百分比(P=0.000，P=0.000)均显著降低，CD8+T淋巴细胞百分比均显著升高(P=0.000，P=0.000)，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值均显著降低(P=0.000，P=0.000)。慢性乙型肝炎患者与慢性HBV携带者相比，CD3+T淋巴细胞百分比的差异无统计学意义(P=0.84)、CD4+T淋巴细胞百分比明显降低(P=0.03)、CD8+T淋巴细胞百分比明显升高(P=0.01)、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值明显降低(P=0.012)。表1 慢性HBV感染者与健康对照组比较T细胞亚群检测结果
　　2.2 慢性HBV携带者HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组比较T淋巴细胞检测结果
　　(见表2)与健康对照组比较，慢性HBV携带者HBV DNA阳性组CD3+T淋巴细胞百分比(P<0.001)、CD4+T淋巴细胞百分比(P<0.001)、CD4+/CD8+T淋巴细胞比值(P<0.001)均显著降低，CD8+T淋巴细胞百分比显著升高(P<0.001)。与HBV DNA阴性组比较，HBV DNA阳性组CD3+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P=0.24)，CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+T细胞比值均显著降低(P<0.001)，CD8+T淋巴细胞百分比显著升高(P<0.01)。HBV DNA阴性组与健康对照组比较，CD3+T淋巴细胞百分比显著降低(P<0.01)，其余各T淋巴细胞亚群差异均无统计学意义(P>0.05)。表2 ASC患者HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组比较T淋巴细胞检测结果
　　2.3 慢性乙型肝炎患者HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组比较T淋巴细胞检测结果
　　(见表3)慢性乙型肝炎患者HBV DNA阳性组与HBV DNA阴性组比较，CD3+、CD4+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义(P=0.485，P=0.344)，但均有下降趋势;CD8+T淋巴细胞百分比显著升高(P=0.000)，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值显著降低(P=0.000)。表3 CHB患者HBV DNA阳性与HBV DNA阴性组比较T淋巴细胞检测结果
　　3 讨 论
　　HBV感染后的免疫清除，对促进肝功能恢复有着根本的意义。HBV的免疫清除依赖于HBV特异性T细胞反应的激活[4]。慢性HBV感染的慢性化主要是人体细胞免疫功能低下所　　致，目前多数学者认为感染HBV后机体的HBV特异性T淋巴细胞反应缺陷或免疫耐受将导致机体长期携带病毒。Rehermann[5]认为感染初期HBV特异性CD8+T淋巴细胞能完全清除HBV，而不引起免疫损伤，随着CD4+T淋巴细胞数目的下降，特异性CD8+T淋巴细胞数目减少、活性降低，不能完全清除HBV。CD4+T淋巴细胞除了可以诱导病毒特异性细胞毒性T细胞并协助其形成多克隆多特异性免疫应答，辅助B细胞产生中和抗体外，还能活化巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)，并增强它们的吞噬或杀伤功能，在病毒感染的潜伏期和急性期起着重要的作用。很早就有报道发现在完全清除病毒的急性HBV感染者体内存在显著的病毒特异性CD4+T淋巴反应，但随着CD4+T淋巴细胞数量的明显下降，CD8+T淋巴细胞活性迅速降低。潜伏期出现的HBV特异性CD4+T和CD8+T淋巴细胞反应说明这些细胞在控制HBV感染中发挥着重要作用。HBV特异性的CD8+T细胞在感染初期能完全清除HBV，而不引起免疫损伤，如不能清除HBV，则在非特异性的CD8+T淋巴细胞的共同作用下引起肝脏损伤[6]。所以在HBV感染后的潜伏期和急性期CD4+T淋巴细胞对特异性CD8+T淋巴细胞的诱导和激活作用在疾病潜伏期和急性期则显得尤为重要，慢性HBV感染者中，由于CD4+T淋巴细胞数量明显下降，活性迅速降低，导致HBV特异性CD8+T淋巴细胞减少，使得HBV不能完全清除造成病情迁延。我们的实验发现在HBV感染者外周血CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞数量下降，CD8+T淋巴细胞数量升高，导致CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值下降，差异具有统计学意义。CD3+T淋巴细胞数量下降提示机体参加细胞免疫反应的免疫活性细胞不足，提示HBV感染者体内细胞免疫功能低下。国内外对慢性HBV感染者免疫功能变化的研究结果也不一，大多数研究结果[7，8]与本实验结果相同，也有结果显示CD3+T淋巴细胞百分比升高[2，4]或CD4+T淋巴细胞百分比差异无统计学意义[9]，或者CD3+T淋巴细胞百分比与健康对照组比较无统计学意义[10，11]，可能与所选病例或检测方法有关。同时我们还发现随着病情发展，从健康对照组到慢性HBV携带者到慢性乙型肝炎组，CD4+T淋巴细胞百分比、CD4+/CD8+比值呈现逐渐下降的趋势，CD8+T淋巴细胞百分比呈现逐渐升高的趋势。对慢性HBV携带者和慢性乙型肝炎患者中HBV DNA阳性与HBV DNA阴性患者的外周血T细胞亚群进行分析，结果显示两组之间差异均有统计学意义，主要是CD8+T淋巴细胞增加，CD4+T/CD8+T淋巴细胞比值下降;提示HBV感染能影响外周血T淋巴细胞亚群的变化，HBV复制水平及HBeAg表达的增加，会加重细胞免疫功能的紊乱。说明HBV感染后，机体免疫功能的改变以CD4+/CD8+比值下降为明显，而该值的持续下降与HBV持续存在和复制水平有关。综上所述，通过对乙肝感染者外周血T淋巴细胞亚群检测，可以了解其免疫功能状态，动态观察CD4+/CD8+比值的变化，为临床观察提供实验指标。
　　【参考文献】
　　[1]Sigal L J，Crotty S，Andino R，et al.Cytotoxic T-cell immunity to virus infected non-haematopoietic cells requires presentation of exogenous antigen[J].Nature，1999，398(6 722)：77-80.

　　[2]Franzese O，Kennedy P T，Gehring A J，et al.Modulation of the CD8+-T-cell response by CD4+，CD25+ regulatory T cells in patients with hepatitis B virus infection[J].Viral，2005，79(6)：3 322-3 328.

　　[3]中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南[J].中华传染病杂志，2011，29(2)：65.

　　[4]何登明，顾长海.慢性 HBV 感染——抗病毒治疗和机体免疫反应性[J].中华肝脏病杂志，2001，1(9)：42-45.

　　[5]Webster G J，Reignat S，Maini M K，et al.Incubation phase of acute hepatitis B in mandynamic of cellular immune mechanisms[J].Hepatology，2000，32(5)：1 117-1 124.

　　[6]Rehermann B.Intrahepatic T cells in hepatitis B：viral control versus liver cell injury[J].J Exp Med，2000，191(8)：1 263-1 268.

　　[7]乔燕伟，游晶，陈红英，等.慢性HBV携带者外周血T细胞亚群的不同年龄变化[J].世界华人消化杂志，2005，13(1)：35-38.

　　[8]李鸣，林蔚.慢性乙型肝炎患者携带者外周血T淋巴细胞亚群的变化[J].现代临床生物医学工程杂志，2002，8(1)：36.

　　[9]黄锦生，张慧敏，陈惠珍.HBV携带者细胞免疫和体液免疫功能的变化[J].中国公共卫生，2002，18(5)：551-552.

　　[10]蔡莉静，薛容，姜长林.乙型肝炎儿童T细胞亚群的改变[J].东南大学学报，2003，22(1)：49-50.

　　[11]李乐，蔡鹏威，伍严安，等.慢性乙肝病毒携带者的细胞免疫功能变化及其与血清HBV DNA的关系[J].福建医药杂志，2003，25(6)：18-20.