生物正交PROTAC用于肿瘤特异性蛋白质降解

异双功能蛋白水解靶向嵌合体 (PROTACs) 在癌症治疗方面具有广阔的潜力，因为它们可以降解癌蛋白，尤其是不可成药的靶标。

尽管前景广阔，但传统的小分子 PROTACs 通常表现出较差的药代动力学并且缺乏肿瘤特异性，由于它们在正常组织中的非特异性分布，可能会导致全身毒性。因此，实现肿瘤特异性递送和增强传统 PROTAC 的抗肿瘤效力仍然是一项艰巨的挑战。

作者首先合成了四种基于VHL的小分子PROTAC，然后设计了一系列含有二硫键可还原活化的POLY-PROTAC，并自组装成胶束纳米粒用于系统的PROTAC递送。随后，设计了一种负载二苯并环辛炔(DBCO)的预靶向纳米颗粒，通过经典的原位点击反应来增强叠氮修饰的POLY-PROTAC纳米颗粒在肿瘤内的蓄积。在内化到肿瘤细胞后，POLY-PROTAC纳米颗粒通过谷胱甘肽(GSH)介导的二硫键还原释放PROTAC，从而降解BRD4蛋白。研究发现，在MDAMB-231乳腺癌小鼠模型中，当POLY-PROTAC纳米颗粒与光动力疗法(PDT)相结合时，可以协同诱导肿瘤细胞凋亡。这项研究可能为肿瘤特异性PROTAC 递送和增强癌症治疗提供一个通用的纳米平台。

POLY-PROTAC纳米粒子的合成与表征

CCK-8 测定显示所有四种PROTACs 均能相当地抑制MDA-MB-231 细胞的增殖。值得注意的是，PROTAC 的半抑制浓度（IC50）比 BRD4 抑制剂 JQ1 低数十倍（图 2d）这表明 BRD4 降解剂比 BRD4 抑制剂更显着地损害肿瘤细胞的增殖。

在中性 pH (7.4) 下，动态光散射 (DLS) 数据和透射电子显微镜(TEM) 检查显示平均流体动力学直径约为 55 nm，POLY-PROTAC NPs 呈球形形态，粒径分布窄（多分散性指数(PDI) < 0.2)。相反，由于酸诱导的 DPA基团质子化和POLY-PROTAC NPs 的解离，无定形聚集体出现在pH 6.0。

在中性 pH (7.4) 下，PPa 标记的POLY-PROTAC NPs 的荧光由于 PPa 分子之间的荧光共振能量转移而被淬灭。相反，在酸性pH（6.2）下荧光发射显着恢复，这模拟了内体细胞器的酸性微环境（pH = 5.8~6.5）。这种现象进一步验证了酸引发的 POLY-PROTAC NPs 的解离，这可能促进 PROTAC 在肿瘤细胞内的释放。

POLY-PROTAC NPs对BRD4的体外降解

流式细胞仪测量确定 PGDA7 组的细胞内荧光信号比PDA7 组高 2.8 倍。共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）检查进一步显示，在孵育 12 小时后检查时，PGDA7 NPs 的细胞内摄取显着高于 PDA7 对照验证了 MMP-2 触发的去聚乙二醇化促进了POLY-PROTAC NPs的内化。

孵育 24 小时后，ARV771 和 MZ1 的 GSH 可激活POLY-PROTAC 在体外有效降解 MDA-MB-231 肿瘤细胞中的 BRD4 蛋白。用 MMP-2 预处理 MMP-2 可脱落的 POLY-PROTAC NPs 显着降低了 PGD7 和 PGDM NPs 的 DC50，分别比 MMP-2 不敏感的 PD7 和 PDM 对应物低 1.9 倍和 3.1 倍，和与游离 ARV771 和 MZ1 相当。

与蛋白酶体抑制剂 MG132 共同处理消除了小分子PROTAC（例如 MZ1 和 ARV771）和 POLY-PROTAC NP（例如 PGDM 和 PGD7）的蛋白质降解能力，验证了泛素-蛋白酶体依赖性 BRD4 降解 POLY-PROTAC NPs 的概况。与 MMP-2 无反应性 PGDO7 对照相比，CCK-8 测定进一步显示 PGDM 和 PGD7 NPs 在孵育 72 小时后的细胞毒性增加。

POLYPROTAC NPs在体内的生物分布和抗肿瘤性能

接下来在体内携带 MDA-MB-231 乳腺肿瘤的 BALB/c 裸鼠模型中研究了 POLY-PROTAC NPs 的肿瘤特异性积累和渗透。荧光成像和 CLSM 检查数据证实了通过 MMP-2 介导的 PEG 的切割增加了 PGDA7 NPs 的肿瘤积累和渗透。

随后在体内 MDA-MB-231 肿瘤模型中探索了 POLY-PROTAC NPs 的抗肿瘤功效。与 PBS 对照相比，游离 ARV771 对 MDA-MB-231 肿瘤生长的影响可以忽略不计。相比之下，PGD7 NPs 显着延迟了约 50% 的肿瘤生长，从而延长了荷瘤小鼠的存活时间。

为了阐明 POLY-PROTAC NPs 抗肿瘤性能的潜在机制，由于来自 POLY-PROTAC NPs 的 ARV771 的递送效率提高，PGD7 NPs 在体内显着抑制 BRD4 在肿瘤组织中的表达约 80%。肿瘤切片的免疫组织化学（IHC）检查显示PGD7 NP显着抑制BRD4表达，BRD4阳性区域比游离ARV771低约4倍。

生物正交点击反应放大了POLY-PROTAC NPs在体内的肿瘤分布

肿瘤分布不足是基于PROTAC的肿瘤治疗的瓶颈之一。因此作者在生物环境中通过无铜点击反应进一步促进POLY-PROTAC NPs的肿瘤特异性积累。

当 PED 和 N3@PGD7 NP 在 pH 6.5 的酸性下共孵育时，DLS 和 TEM 检查显示具有广泛尺寸分布的无定形聚集体，验证了 DBCO 结合的 PED 共聚物之间发生了多价点击反应和叠氮化物修饰的 POLY-PROTAC NPs 形成交联的纳米结构。

当将PED预靶向 的NP尾静脉注射到携带MDA-MB-231肿瘤的裸鼠中时，显示出清晰的瘤内荧光信号，这是由肿瘤酸度引发的EPA叔胺质子化和随后PED NP的解离引起的，这促进了 DBCO 和 ECM 中 POLY-PROTAC NPs 表面上的叠氮基之间的点击反应。

通过注射后 48 小时主要器官和肿瘤组织的离体荧光成像验证了 POLY-PROTAC NPs 增加的肿瘤分布。来自荧光成像和 HPLC分析的数据提供了一致的证据，即原位点击反应显着增强了 ARV771 PROTAC 在肿瘤部位的积累和保留。

生物正交POLY-PROTAC NPs 可抑制体内乳腺肿瘤的生长

作者接下来研究了它们在体内 MDA-MB-231 肿瘤模型中的抗肿瘤性能。ARV771 在肿瘤组织中的分布增加，PED + N3@PGD7 更有效地延迟了约 70% 的 MDA-MB-231 肿瘤生长。PED + N3@PGD7略微延长了荷瘤小鼠的存活时间，这是由于抗肿瘤研究后期的肿瘤复发。

Laser + PGDA7NPs的组合比PDT（Laser + PGDA）或单独使用PGDA7的BRD4降解更有效地激活MDA-MB-231肿瘤细胞中的caspase-3蛋白，这意味着PDT结合的改善的细胞凋亡诱导性能与BRD4 体外降解。

接下来在体内研究了结合 PDT 与 BRD4 降解的抗肿瘤性能。表明单独施用PDT或ARV771略微抑制了MDA-MB-231肿瘤的增殖。相比之下，生物正交 NPs (PED + N3@PGDA7) 和 PDT 的组合显着降低了 95% 的肿瘤生长，比单独由 PED + N3@PGDA7 处理引起的 BRD4 降解效率高 1.5 倍。

此外，与 PED + N3@PGDA7 组相比，PED 预靶向 NPs 与 N3@PGDA7和 PDT 组合使荷瘤小鼠的存活期延长了 40%，其中 40% 的动物在治疗后存活了 100 天。肿瘤切片的 TUNEL 染色显示 PED + N3@PGDA7 + PDT 组小鼠的肿瘤细胞显着凋亡，表明 PDT 和 BRD4 降解与生物正交 NPs 的组合累积诱导了体内肿瘤细胞的凋亡。通过肿瘤切片的离体H&E染色进一步证实了治疗诱导的肿瘤细胞凋亡。

在实验期间观察到可忽略不计的体重减轻和主要器官的组织病理学损伤，验证了POLY-PROTAC NPs 令人满意的生物安全性。肿瘤组织的免疫组织化学检查显示体内BRD4表达显着降低。值得注意的是， PDT 增强了 ARV771 PROTAC 在体内的细胞内释放。此外，PED + N3@PGDA7 + Laser 的联合治疗比 PED+ N3@PGD7 更有效地激活 caspase-3（1.8 倍）和降解 BRD4（3.0 倍），验证了 PDT 和 BRD4 联合引起的协同凋亡诱导谱退化。

总结

作者设计了一种可激活肿瘤微环境的 POLY-PROTAC 纳米平台，用于肿瘤特异性递送和增强 PROTAC 的抗肿瘤性能。与它们的小分子 PROTAC 对应物相比，本研究中报道的 POLY-PROTAC NPs 具有几个明显的优势。首先，POLY-PROTAC NPs 延长了小分子 PROTAC 的血液循环。其次，POLY-PROTAC NPs 可以在瘤内酸性微环境中分解。因此，PROTAC 前药可以通过 GSH 介导的二硫键断裂在胞质溶胶中恢复。此外，证明了 POLY-PROTAC NPs 可以适应生物正交点击反应增强的肿瘤特异性。