11+! 结肠癌中基于 m6A 调节因子的甲基化修饰模式以不同的肿瘤微环境免疫谱为特征

m6A调控因子的表达异常和基因变化与恶性肿瘤进展和免疫调节异常相关。

  背景介绍 近年来，已经有越来越多的研究从m6A调控因子的角度出发研究癌症的免疫相关信息。

 数据介绍 CC样本的基因表达数据和临床特征回顾性收集于NCBI GEO数据库和TCGA数据库的公开数据集。 T CGA RNA测序数据(FPKM格式)从UCSC Xena 下载，并转换为 TPM 格式。 TCGA-COAD的基因组突变数据(包括体细胞突变和拷贝数变异)来自UCSC Xena数据库和Davoli等人 的 研究。

    结肠癌中m6A调控因子的遗传变异概况   在本研究中，作者研究了23个m6A RNA甲基化调控基因在CC中的作用，包括writers、readers、erasers。结果如图1A所示，这些m6A调控因子的动态可逆过程可以识别、移除和添加m6A修饰位点，并改变大量的生物学过程，如RNA剪接、RNA翻译和RNA降解。对23个m6A调控因子进行了GO富集和me[x]ta分析，显著富集通路如图1B所示。 测定了 CC中23个m6A调控因子体细胞突变的发生率 ，结果如图1C-D所示， CN V突变普遍存在 ， 23个m6A调控子在染色体上的CNV改变位置如图1E所示 。 接下来作者基于配对的肿瘤正常样本进行主成分分析(PCA)，发现23个m6A调控因子完全区分了CC样本和正常样本(图1F)。进一步分析显示相关基因在肿瘤样本中上下调差异显著。

02   23个调控因子介导的m6A甲基化修饰模式的鉴定   23个m6A调控因子之间的相互作用、调控因子连接及其在CC患者中的预后意义如图2A所示，结果表明，“writers”、“readers”和“erasers”三个调控因子之间的交互作用可能在m6A不同修饰模式的形成中起着重要作用，并与肿瘤的发病和发展有关。因此作者采用NMF算法的共识聚类分析对从GEO获得的癌症样本进行分层，共确定了三个不同的修正型聚集区（图2B），分别命名为m6A-C1（221）、m6A-C2（530）和m6A-C3（162），其中m6A-C1生存好，m6A-C3的预后差。 接下来作者 对TCGA-COAD队列进行了相同的分析，得到了相似的结果。

03   m6A修饰模式具有明显的免疫景观特征   为了探究三种不同m6A修饰模式下的生物分子变化，作者对Hallmarker基因集进行了GSVA富集分析，结果显示，m6A-C1在免疫激活相关过程中显著富集，m6A-C3富集通路与致癌激活和基质通路显著相关，m6A-C2在免疫调节和基质相关信号通路中都高度富集。 为可视化和比较不同m6A修饰模式下28个免疫浸润细胞亚群的相对丰富度，作者使用ssGSEA构建了一张热图，发现抗肿瘤淋巴细胞亚群，如效应记忆CD4+/CD8+ T细胞，主要富集于m6A-C1和m6A-C2亚型，而在m6A-C3亚型中，调节性T细胞等明显升高。作者还使用CIBERSORT进一步表征了免疫浸润剖面，使用支持向量回归评估TME中的免疫细胞子集，在m6A甲基化修饰分层中也观察到了一致的结果。

接下来，作者使用ESTIMATE算法来量化三种修饰模式的整体免疫细胞浸润(immune Score)和肿瘤细胞纯度(tumor purity)，结果显示，m6A-C1的免疫评分高，其次是m6A-C2和m6A-C3。相反，m6A-C3的肿瘤纯度高于m6A-C2和m6A-C1，说明m6A-C2和m6A-C1亚型肿瘤被更多的非肿瘤成分(如免疫细胞和基质细胞)包围。 目前有研究将CC患者分为4个主要分子亚型(CIN、CSC、dMMR和KRASm)，本研究发现CIN亚型主要集中在m6A-C2和m6A-C3，而dMMR亚型主要集中在m6A-C1肿瘤内。已知PD-L1是预测抗PD-1/L1治疗反应的成熟生物标志物，作者还比较了不同m6A修饰簇中PD-L1的表达水平，发现在m6A- c1亚型显著上调。以上结果证实了这三种m6A修饰模式具有不同的免疫浸润特征。 04   结肠癌中m6A表型相关的DEGs   为了研究3种m6A修饰表型中潜在的基因改变和表达扰动，本研究进一步研究了CC中三种m6A修饰模式中可能存在的m6A相关转录表达变化，应用经验贝叶斯方法确定了三种m6A修饰模式之间的重叠差异表达基因(DEGs)。 对这些特征基因的GO富集分析显示，与RNA修饰、转录和免疫调节相关的生物过程显著富集。

基于524个具代表性的m6A表型相关标记基因，作者进行了无监督一致性聚类分析，获得了3个稳定的转录组表型。这些分层将患者分为三个不同的m6A基因标记亚组，具有不同的临床病理特征，并被定义为m6A基因- s1、m6A基因- s2和m6A基因- s3，作者发现临床晚期患者以m6A基因-S3亚组为代表，CIN亚型和PD-L1表达下调的患者主要集中在m6A基因- s2和S3亚组。接下来作者进行了生存分析，m6A基因- s1标记被证明与较好的预后相关，而m6A基因- s3与较差的生存结果相关，考虑年龄、性别、MMR和分期后，m6A基因标记与生存率之间的相关性仍具有统计学意义。   05   m6Sig评分的构建及其临床相关性的探讨   为了准确预测单个肿瘤中m6A甲基化修饰的模式，作者开发了一个评分方案，称为m6Sig评分，该评分方案基于已识别的m6A相关标记基因，以量化单个CC患者的m6A修饰模式，使用桑基图说明了m6Sig评分构建的工作流程。作者通过Spearman分析检验了已知生物特征和m6Sig得分之间的关系。相关矩阵的热图显示，m6Sig评分与免疫激活过程和DNA修复签名显著负相关，但与EMT和基质相关签名正相关。 此外，作者还确定m6Sig评分在预测生存结局方面的预后能力，结果显示低m6Sig分数患者有更好的预后显著相关CIT队列。并且作者探索了m6Sig评分与分子亚型之间的关系，发现dMMR亚型与m6Sig评分低于其他CC亚型。PD-L1的表达水平，在m6Sig低评分组也被发现有明显的升高。

结合TCGA-COAD数据库的临床特征和基因组信息，作者对构建的m6A评分系统进行验证。研究发现，m6Sig评分在TCGA队列中具有潜在的预后预测价值，m6Sig评分低的患者具有显著的生存获益。TCGA分析显示了CC的综合分子特征，并建议根据MSI状态将肿瘤细分为4个亚型。MSI-H亚型样本的m6Sig评分显著低于其他三种亚型样本。

越来越多的证据表明，肿瘤基因组体细胞突变和免疫治疗反应之间的联系。因此作者研究了肿瘤突变负荷在不同m6Sig评分组中的分布规律，发现m6Sig评分低的组突变频率更高。作者发现在m6Sig低得分亚组中，体细胞拷贝数改变(SCNA)的频率更高，即SCNA与免疫逃避和肿瘤细胞增殖呈正相关。作者进一步对CC样本中m6Sig低分组和高分组进行了显著突变基因(SMG)分析。SMG突变图谱显示，PIK3CA和SMAD4在m6Sig低评分组中有较高的体细胞突变率，而TP53在m6Sig高评分亚型中有较高的体细胞突变率。为了进一步了解在CC中起作用的突变过程，作者从TCGA-COAD突变谱中提取了三个突变标记（1,6,10），结果发现，m6Sig低得分亚型具有显著更高比例的突变特征6 。 06   m6Sig评分在预测免疫治疗益处中的作用   免疫治疗无疑是抗肿瘤治疗的重大突破，作者发现，TIDE在m6Sig低评分组中显著降低，而IPS在m6Sig低评分组中显著升高(TIDE在TCGA-COAD和CIT中的分布，;IPS在TCGA-COAD和CIT中的分布，、。这些发现间接证明肿瘤m6A修饰模式的表达在介导免疫应答中起着至关重要的作用。 由于m6Sig评分与免疫反应的强相关性，作者研究了m6A修饰标记是否可以预测三个独立免疫治疗队列中患者对ICI治疗的反应。 结果发现，在抗PD1队列和抗CTLA4队列中，m6Sig低评分组患者表现出显著的临床优势和显著延长生存期( 抗PD-1, ，抗CTLA-4, )。 与m6Sig评分高的患者相比，m6Sig评分低的患者证实了ICI治疗的显著治疗效益和免疫应答(抗PD-1，；抗CTLA-4，)。研究结果证明，m6Sig评分与免疫治疗的反应有关，可以进一步预测患者的预后。