苦参碱对肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞的影响

作者：皇甫超申，刘彬，耿旭，房娜，谷敬丽
　　【摘要】 目的: 研究不同浓度苦参碱对肝癌患者肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)增殖、体外杀瘤活性的影响. 方法: 将苦参碱分为0.1，0.2，0.4，0.6，0.8 g/L 5个浓度组，分别加入含有IL2的DMEM培养基，体外诱导扩增TIL,通过MTT法检测TIL增殖、体外杀瘤活性，采用流式细胞术测定T淋巴细胞亚群，研究苦参碱体外对肿瘤免疫功能的影响. 结果：苦参碱低浓度组(终浓度分别为0.1，0.2 g/L)对TIL作用不明显, 高浓度组(终浓度为0.8 g/L)能抑制TIL增殖和体外杀瘤活性(P<0.01)，中浓度组(终浓度分别为0.4, 0.6 g/L)能促进TIL增殖和体外杀瘤活性(P<0.01)，CD8+数量有所增加，CD4+/CD8+比值有所下降(P<0.01). 结论: 合理利用苦参碱可增强患者肿瘤免疫能力.

　　【关键词】 苦参碱;淋巴细胞,肿瘤浸润;癌，肝细胞
　　【Abstract】 AIM: To explore the effect of different concentrations of matrine on proliferation and activity of tumorinfiltrating lymphocytes (TIL) of patients with hepatocellular carcinoma in vitro. METHODS: Different concentrations of matrine (0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L) were respectively added into DMEM medium supplemented with IL2. The effect of matrine on proliferation and activity of TIL in vitro was studied by MTT, and the Phenotype was detected by flow cytometry (FCM). RESULTS: The lower concentration of matrine (0.1, 0.2 g/L) had no effect on TIL. High concentration of matrine (0.8 g/L) had a remarkable inhibitory effect on proliferation and antitumor activity of TIL (P<0.01). The middle concentration of matrine (0.4, 0.6 g/L) enhanced the proliferation and antitumor activity of TIL in vitro (P<0.01). The percentage of CD8+ increased and the ratio of CD4+/CD8+ decreased (P<0.01). CONCLUSION: The reasonable use of matrine could enhance the patients specific antitumor immune function.

　　【Keywords】 matrine; TIL; hepatocellular carcinoma

　　0引言

　　苦参碱作为一种传统的中药成份，可抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和分化，调节肿瘤宿主免疫功能，目前已成为抗癌中药研究的一个热点. 但有关苦参碱对免疫功能的影响目前存在很多争议[1]. 且相关研究多以患者外周血单个核细胞、淋巴器官内淋巴细胞、血清淋巴因子为研究对象，未见有关苦参碱对宿主抗肿瘤细胞免疫的主力肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltrating lymphocyte,TIL)抗瘤活性及机制的研究报道. 为此，我们选择从肝癌患者新鲜肿瘤组织中分离的TIL为研究对象，探讨苦参碱对其抗瘤活性的影响及可能机制.

　　1对象和方法
　　1.1对象

　　肝癌患者13例(男10，女3)，平均年龄45.6(37~58)岁. 手术切除的瘤体平均直径5.2 cm，病理学诊断均为原发性肝细胞肝癌. 苦参碱购自西安天琪植物化学有限公司，分子质量248.37，纯度大于98%，临用前用PBS配成工作浓度. IL2, 刀豆蛋白A(ConA), DMEM培养液、MTT，Ⅱ型胶原酶(美国Sigma公司).胎牛血清(华美生物工程公司)，淋巴细胞分离液(上海试剂二厂).

　　1.2方法

　　1.2.1肝癌细胞和TIL分离、表型鉴定无菌切取新鲜人肝癌标本，剪碎，1 g/L Ⅱ型胶原酶消化，过滤，制成细胞悬液，用淋巴细胞分离液，不连续密度梯度分离法分离出TIL和肝癌细胞. 瑞氏染色鉴定. 肝癌细胞常规培养. TIL(5×108个/L)加入含rhIL2 5 U/L的培养液中，试验组加入苦参碱，分低浓度组(终浓度分别为0.1,0.2 g/L)中浓度组(终浓度分别为0.4, 0.6 g/L)高浓度组(终浓度为0.8 g/L)，空白对照组不加苦参碱，只加等量的培养液，体外扩增2 wk. T淋巴细胞亚群测定采用流氏细胞术(FACSCalibur),淋巴细胞三色荧光标记，试剂由美国Beckman coulter公司提供.

　　1.2.2苦参碱对TIL体外扩增作用根据IL2诱导TIL增殖情况，选用1 U/L IL2作为应用浓度，将含IL2的TIL细胞悬液(5×108个/L，100 μL/孔)加入96孔平底培养板中，试验组加入苦参碱(终浓度分别为0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L)每孔100 μL/孔. 空白对照组不加苦参碱，只加等量的培养液. 每组设3个复孔. 每2 d记数1 次. 记数后再调整细胞密度为1×1010个/L,继续培养.

　　1.2.3淋巴细胞转化试验(MTT法)试验组为含5 μg/ L ConA的TIL悬液, 加入苦参碱溶液, 使其终浓度分别为0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 g/L,阳性对照组仅含5 μg/L ConA, 空白对照组为加入等体积PBS 溶液的TIL悬液. 将上述细胞悬液分别加入到96孔细胞培养板中, 每孔200 μL,各组均设6个复孔. 96孔培养板置37℃, 50 mL/L CO2孵箱中培养72 h后, 离心弃上清液, 再加入培养液150 μL和5 mg/L MTT溶液20 μL, 继续培养4 h. 培养结束后每孔加入150 μL二甲基亚砜, 振荡2 min溶解沉淀, 混匀后以酶标仪读取各管A570 nm值. 计算刺激指数(SI). SI(%)=(实验孔A570 nm均值/ConA孔A570 nm均值)×

　　1.2.4苦参碱对TIL细胞体外杀伤肿瘤细胞的影响将TIL作为效应细胞，试验组取上述不同浓度苦参碱作用过的TIL,用培养液洗涤3次，空白对照组用未经苦参碱作用的TIL. 原代培养的自体肝癌细胞为靶细胞，按效靶比20∶1的比例，取1×105个TIL约100 μL与肝癌细胞5×103个约100 μL混合加入96孔板中，每组样品设3个复孔. 将培养板置饱和湿度、37℃, 50 mL/L CO2孵箱内培养20 h，每孔加入5 g/L MTT 20 μL,继续培养4 h，离心、弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO) 200 μL,震荡5 min，用酶联免疫检测仪测A570 nm值，计算杀伤率. 杀伤率(%)=(A靶+A效)-A(效+靶)/A靶×

　　统计学处理: 实验结果以x±s表示,用SPSS 10.0对多组间比较进行方差分析，两两比较用Dunnett t检验.

　　2结果

　　2.1苦参碱对TIL体外增殖的作用
　　2.1.1TIL 体外增殖计数对照组和低浓度组TIL 在体外培养的初期7 d无明显生长,渡过此生长抑制期后, TIL扩增, 14 d扩增2～3倍. 中浓度组TIL在培养的第4日开始生长,14 d扩增近50倍. 高浓度组TIL在培养的第7日开始生长, 14 d扩增近1倍. 空白对照组和低浓度组TIL 悬液中的肿瘤细胞,在培养的第4日开始死亡,至第14日基本全部消失. 中浓度组和高浓度组TIL 悬液中的肿瘤细胞在培养的第2日开始死亡,至第5日全部消失(瑞氏染色法检测).

　　2.1.2TIL体外增殖活性苦参碱在低浓度条件下对TIL增殖抑制作用不明显，在高浓度条件下对TIL增殖有抑制作用，中等浓度条件下对TIL增殖有促进作用(表1).表1苦参碱对IL2诱导TIL体外增殖的作用(略)

　　2.2苦参碱对TIL亚群增殖的影响新分离的TIL主要为CD3+细胞(64.11± 3.84), CD3+CD4+ (30.12±1.40), CD3+CD8+(28.31±1.62), CD4+/ CD8+(1.21±0.24). 苦参碱在中等浓度条件作用下,CD4+细胞下降，CD8+上升，CD4+/ CD8+降低，在低浓度、高浓度、空白对照组T细胞各亚群比例变化不明显(表2).表2苦参碱对TIL亚群增殖的影响(略)

　　2.3苦参碱对TIL细胞体外杀伤肿瘤细胞的影响空白对照组TIL对肿瘤细胞杀伤率为48.6±3.2, 与此相比， 苦参碱在低浓度条件下并不能提高TIL增体外杀瘤活性(杀伤率分别为50.8±2.9，49.7±2.5，P>0.05)，在高浓度条件下对TIL杀瘤活性有抑制作用(杀伤率为37.2±2.5, P<0.05)，中等浓度条件下对TIL杀瘤活性有促进作用(杀伤率分别为69.4±1.6，72.2±2.0)，中等浓度苦参碱作用TIL对肿瘤细胞半数致死时的药物浓度(IC50)>0.35 g/L (P<0.01).

　　3讨论

　　免疫系统作为机体抗肿瘤的道防线,在恶性转化细胞的识别和清除过程中发挥着重要作用,荷瘤宿主自身免疫状态的好坏与肿瘤的发生、发展及预后密切相关. 许多具有抗肿瘤作用的中药都可通过改善荷瘤机体的免疫功能低下状态而发挥抑瘤活性. 许多试验表明苦参碱具有免疫调节功能. 一些研究认为苦参碱通过抑制巨噬细胞的吞噬功能、LAK细胞的活性和T细胞增殖而发挥免疫抑制作用[3]. 另一些实验认为苦参碱有促进肿瘤宿主的抗肿瘤免疫反应功能, 特别是以细胞毒性T 细胞(CTLs)为免疫效应子的免疫反应是机体抗肿瘤的主要防御机制,它的有效激活可明显改善肿瘤的预后[4]. 用氧化苦参碱喂饲荷瘤小鼠,发现实验组小鼠较对照组瘤体明显减小,而实验组小鼠NK细胞、胸腺有核细胞增多,血中IL2活性增强[5]. 我们的试验结果显示，低浓度苦参碱对TIL增值、表型、体外抗瘤活性几乎不起作用，高浓度苦参碱对TIL增值、体外抗瘤活有抑制作用，只有在中等浓度下，苦参碱才表现出协同IL2刺激TIL增值、提高体外抗瘤活的作用. 提示苦参碱对肿瘤免疫的调节具有双向性.

　　我们的试验结果与文献差异，说明研究对象不同、研究方法不同，从而使实验结果缺乏可比性. 文献多采用肿瘤患者外周血淋巴细胞为研究对象，有人选用的药物是氧化苦参碱，具体试验步骤差异很大，所以得出的结果不同.

　　肿瘤微环境中招募的TIL抗肿瘤作用已被许多试验证实[6]. 以TIL为研究对象，可以更好地揭示苦参碱对肿瘤免疫的作用. 一般认为CD8+淋巴细胞中的Tc亚群在CD4+辅助下，被肿瘤抗原信号刺激分泌淋巴因子，自身被激活，在肿瘤局部发挥细胞毒性作用，从而特异性杀伤肿瘤细胞. 肿瘤组织中CD8+数量愈多，患者预后愈好[7]. 我们新分离的TIL CD4+/CD8+比值为1.21±0.24，说明肿瘤局部细胞免疫被抑制. 低浓度苦参碱对患者TIL作用不明显的机制可能是对细胞分化不起作用，也不足以引起细胞凋亡. 高浓度苦参碱可抑制细胞增值，促使细胞凋亡，从而抑制TIL体外扩增，使其数量减少，抗肿瘤效应减低. 经中等浓度苦参碱与IL2共同作用96 h，CD8+数量有所增加，CD4+/CD8+比值有所下降. 说明中等浓度苦参碱增强肿瘤细胞免疫的机制主要是刺激CD8+细胞分化. 提示合理利用苦参碱，可增强患者肿瘤免疫能力.

　　基金项目：河南省科技攻关项目(0124170229)

　　【参考文献】
　　[1]胡淑平，徐惠波，招守瑞，等.苦参类生物碱抗肿瘤作用研究[J].特产研究, 2004，26(3):43-46.

　　[2]马凌娣，文世宏，张彦，等. 苦参碱对H2荷瘤小鼠的抑瘤作用及对免疫功能的影响[J].中草药, 2004，35(12)：1374-1377.

　　[3]马凌娣，张彦，文世宏，等.苦参碱对荷瘤小鼠作用的实验研究[J].中华肿瘤杂志，2005，27(6)：339-341.

　　[4]张鸣杰, 黄建. 苦参碱类抗肿瘤作用机制研究的新进展[J]. 　中国中药杂志, 2004, 29(2)：115-118.

　　[5]徐广伟,满世军,王志生,等. 氧化苦参碱对荷瘤小鼠免疫功能的影响[J]. 中国临床康复，2001,8(5):9-10.

　　[6]Dudley ME,Wunderlich JR,Robbins PF,et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor, lymphocytes[J].Science, 2002,298(5594): 850-854.

　　[7]Sato E, Olson S H, Ahn J, et al.Intraepithelial CD8+ tumorinfiltrating lymphocytes and a high CD8+/regulatory T cell ratio are associated with favorable prognosis in ovarian cancer[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005,102(51): 18538-18543.