槐定碱预处理对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞c-Jun表达的影响

　　作者：刘静,张巍,杨峰,黄菱,周娅　　作者单位：宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学教研室，银川 750004

　　【摘要】目的 观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞c-Jun表达的影响，探讨槐定碱抗内毒素机制。方法 培养RAW264.7巨噬细胞，以槐定碱(31.25mg•L-1)预处理细胞24h后给予LPS(E.coli O55:B5)100μg•L-1刺激细胞，并于刺激后5、30、60、120min收集细胞;再以槐定碱31.25、15.63、7.81mg•L-1三个浓度同上预处理细胞，于LPS刺激后60min收集细胞。利用免疫细胞化学技术检测RAW264.7巨噬细胞中c-Jun的表达。结果 单独槐定碱对c-Jun表达无影响;LPS模型组各时间点c-Jun阳性细胞数均显著高于巨噬细胞对照组(P<0.01)，且随LPS刺激时间延长而升高，持续升至120min;槐定碱预处理组在LPS作用后30、60、120min时c-Jun阳性细胞数均较同时间点LPS模型组降低，差异有统计学意义(均P<0.01)，但槐定碱预处理组各时间点c-Jun阳性细胞数无明显变化。不同浓度槐定碱(31.25、15.63、7.81 mg•L-1)预处理细胞，对LPS刺激的c-Jun表达均有显著抑制作用(均P<0.01)，且31.25 mg•L-1的作用强于另两个浓度(15.63、7.81 mg•L-1)，差异有统计学意义(均P<0.05)。结论 槐定碱预处理RAW264.7巨噬细胞能显著抑制LPS诱导的c-Jun蛋白表达，其作用有剂量依赖性。
　　【关键词】 槐定碱;LPS;RAW264.7巨噬细胞株;c-Jun

　　Effects of Sophoridine Pretreating on the ex[x]pression of c-Jun in Macrophage RAW264.7 Induced by LPS

　　(Dept. of Pathogenic Biology and Immunology,Ningxia Med.Univ.,Yinchuan 750004)

　　Abstract: ob[x]jective To explore the anti-endotoxin fuctions and its mechanisms by observing the effects of Sophoridine pretreating on the ex[x]pression of c-Jun in macrophage RAW264.7 induced by LPS.Methods Cultured RAW264.7 cells,using LPS(E.coli O55:B5) at final concentration of 100μg•L-1 to stimulate cell after Sophoridine pretreating cells for 24 hours,and collecting cells at 5min,30min,60min,120min after stimulating;then using Sophoridine (31.25,15.63,7.81mg•L-1) preatreating cells again，and collecting cells at 60 min after LPS stimulating.The ex[x]pression of c-Jun in macrophage RAW264.7 was detected by Immunocytochemistry.Results Single Sophoridine had no effect on the ex[x]pression of c-Jun.The positive cells of c-Jun of LPS model group at each time spot were significantly higher than those of macrophage control group(P<0.01),and the positive cells ascended along with time,reached summit at 120 min.Compared with LPS model group,the positive cells of c-Jun in Sophoridine pretreating group had significantly decreased after LPS stimulating at 30min,60min,120min (all P<0.01),but the number of the positive cells of c-Jun of Sophoridine pretreating groups had no obvious change at each time spot.Different concentration (31.25,15.63,7.81 mg•L-1) Sophoridine pretreating cells had significantly inhibitory action(all P<0.01),and the action of 31.25 mg•L-1 had the advantage over other concentration(15.63,7.81 mg•L-1) (all P<0.05).conclusion Sophoridine pretreating macrophage RAW264.7 can inhibit the ex[x]pression of c-Jun protein induced by LPS,and its action show the dose dependent.

　　Key words:sophoridine; LPS; RAW264.7 Cells; c-Jun

　　细菌内毒素(endotoxin，ET)即脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)，是G-菌的主要病原相关分子模式(Pathogen associated molecular pattern,PAMP)，巨噬细胞等通过模式识别受体(Pattern recognition receptors,PRR)结合PAMPs，导致炎症失控性表达,对机体造成严重损害。c-Jun蛋白是细胞核内转录因子激活蛋白1(activator protein-l，AP-1)的主要组分之一，它参与了LPS的细胞内信号转导和转录调控。槐定碱( sophoridine )是豆科槐属植物苦豆子(Sophora alopecuroides,L)中含量较高的生物碱之一，前期研究发现槐定碱可显著减轻内毒素肺损伤小鼠的病理损伤[1]。本文拟进一步观察不同浓度槐定碱预处理小鼠单核/巨噬细胞株(RAW264.7)巨噬细胞，以及LPS刺激槐定碱预处理细胞后不同时间点c-Jun表达的变化，以探讨槐定碱抗内毒素的作用机制。
　　1 材料与方法
　　1.1 药品和试剂
　　槐定碱购于宁夏药物研究所，批号:960324，mp 109℃，含量98%以上;RAW264.7来源于中科院上海细胞库;抗小鼠c-Jun多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司;胎牛血清购于杭州四季青公司;DMEM为美国Gibco 公司;胰蛋白酶、LPS(E.coli O55:B5)均系美国Sigma 公司产品;兔SP检测试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥;TritonX-100，北京中山试剂公司。
　　1.2 实验方法

　　1.2.1 药品配制

　　称取槐定碱,无内毒素三蒸水溶解，10 N HCl调节pH值至7.2～7.4之间，使用前稀释至所需浓度。称取LPS,无内毒素三蒸水溶解，使用前旋涡混旋器混旋30min,稀释至所需浓度。
　　1.2.2 实验分组

　　培养RAW 264.7巨噬细胞，待其处于对数生长期时用于实验。0.25%胰酶消化细胞，混悬，调节细胞浓度为1×106个•mL-1。将无菌盖玻片放入六孔培养板中，接种细胞悬液，每孔1mL，待细胞80%融合后分组处理。巨噬细胞(Mφ)对照组：无血清DMEM培养基孵育细胞;槐定碱对照组：含槐定碱31.25mg•L-1培养基孵育细胞24h后给予无血清DMEM培养基孵育细胞;LPS模型组：含LPS 100μL•L-1培养基孵育细胞;槐定碱预处理组：含槐定碱31.25mg•L-1培养基孵育细胞24h后给予含LPS 100μL•L-1培养基孵育细胞。各组分别给予无血清DMEM培养基或含LPS 100μL•L-1培养基孵育细胞后5、30、60、120min收集细胞爬片。每个处理方式重复3次。观察槐定碱预处理对LPS刺激RAW264.7细胞后不同时间点c-Jun 表达的影响。
　　同时，槐定碱对照组和槐定碱预处理组分别用含槐定碱31.25、15.63、7.81mg•L-1三个浓度的培养基孵育细胞24h后，分别给予无血清DMEM培养基和含LPS 100μL•L-1培养基孵育细胞60min，收集细胞爬片。重复3次。观察不同浓度槐定碱预处理对LPS刺激RAW264.7细胞后c-Jun 表达的影响。
　　1.2.3 免疫细胞化学收集各组细胞爬片，4%多聚甲醛固定30min，0.3%TritonX100室温下30min，3%过氧化氢室温10min，5%山羊血清封闭室温下10min,不洗甩干，加1∶200稀释的c-Jun一抗(兔抗小鼠c-Jun多克隆抗体)，37℃湿盒内120min，加1∶200稀释的二抗(辣根酶标记山羊抗兔IgG)，37℃湿盒内90min，1∶200稀释的SP(过氧化物酶标记的链酶卵白素) 37℃湿盒内30min，DAB(辣根过氧化物酶底物显色剂)室温下显色3min，苏木素复染3s,依次经过80%、95%、、酒精脱水各1min,二甲苯中透明5min,中性树胶封片。采集图像。结果判定：细胞核内着棕黄色为阳性细胞，蓝色为阴性细胞。400×显微镜下观察,每一细胞爬片随机选取3个视野计数阳性细胞数及细胞总数，计算阳性百分率 (%)，每组重复3次。
　　1.3 统计学方法
　　所有数据均采用SPSS 11.5统计软件分析,组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果

　　2. 1 槐定碱预处理对LPS刺激RAW264.7细胞后不同时间点c-Jun蛋白表达的影响
　　结果表明Mφ对照组与槐定碱对照组之间各时间点c-Jun阳性细胞数差异均无统计学意义(P>0.05);LPS模型组各时间点c-Jun阳性细胞数均显著高于同时间点Mφ对照组(χ2=45.239,P=0.000;χ2=281.841,P=0.000;χ2=396.366,P=0.000;χ2=1776.592,P=0.000)，而且c-Jun表达随LPS刺激时间延长而升高，持续升至120min。槐定碱预处理组，在LPS作用5min时与LPS模型组比较差异无统计学意义(χ2=3.13,P=0.077)，在30、60、120min时槐定碱预处理组c-Jun阳性细胞数较LPS模型组显著降低(分别为χ2=136.44,P=0.000;χ2=216.42,P=0.000;χ2=1747.59,P=0.000)，但均显著高于同时间点Mφ对照组(分别为χ2=21.57,P=0.000;χ2=29.46,P=0.000;χ2=30.61,P=0.000;χ2=41.69,P=0.000)。槐定碱抑制LPS诱导的c-Jun表达的时间效应与LPS模型组不平行，槐定碱预处理组各时间点c-Jun阳性细胞数均无明显变化。结果见表1，图1(见封3)。表1 槐定碱对LPS诱导RAW264.7细胞不同时间点c-Jun表达的影响(略)

　　2.2 不同浓度槐定碱预处理对LPS刺激后RAW264.7细胞c-Jun蛋白表达的影响
　　三个浓度槐定碱(31.25 、15.63 、7.81 mg•L-1)预处理RAW264.7细胞，其c-Jun阳性细胞数均与Mφ对照组差异无统计学意义(分别为χ2=0.01，P=0.92;χ2=0.02，P=0.90;χ2=0.07，P=0.78),说明所用的三个浓度槐定碱本身均不影响RAW264.7细胞的c-Jun表达。三个浓度槐定碱预处理组分别用LPS刺激60min后其c-Jun阳性细胞数均显著少于同时间点LPS模型组(分别为χ2=216.421，P=0.000;χ2=151.519，P=0.000;χ2=133.251，P=0.000)，但均显著高于Mφ对照组(分别为χ2=30.61,P=0.000;χ2=90.55,P=0.000;χ2=102.44,P=0.000)。31.25 mg•L-1槐定碱的效应与另两个浓度(15.63、7.81 mg•L-1)比较差异有统计学意义(均P<0.05)。结果见表2。表2 同浓度槐定碱对LPS诱导RAW264.7细胞c-Jun表达的影响(略)

　　3 讨论

　　近年的研究表明，LPS激活巨噬细胞表面Toll-like receptors 4(TLR4)后，在细胞内通过信号通路逐级转导，主要从两个方向分别激活转录因子NF-κB和AP-l，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路是其中之一，它普遍存在于多种生物体内，是导致炎症反应发生的大多数细胞因子转录、蛋白生成的下游阶段。目前己确定的MAPK信号转导通路有四条[2]，即细胞外信号调节激酶(ERK1/2)、c-Jun N端激酶(JNK)/应激活化蛋白激酶(SAPK)、p38MAPK和ERK5/BMK1四条通路。其中c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino terminal kinase,JNK)信号转导通路主要参与细胞因子和环境应激，如内毒素、炎症等引起的细胞反应。JNK被LPS激活以后，活化的JNK可磷酸化c-Jun蛋白N-末端并增强其转录活性，c-Jun N末端磷酸化后还可促进c-Jun和c-fos异二聚体与同二聚体的形成，这些二聚体可以与许多炎症因子基因启动子区的AP-1结合位点结合，增强这些基因的转录活性[3-4]，终促使TNF-а、NO、ICAM-1等炎症因子的大量失控表达而致病[5-8]。因此c-Jun是JNK信号转导通路下游AP-1家族中的一个关键的信号分子,LPS刺激细胞后经过一系列的信号转导逐级放大可引起c-Jun蛋白的变化。　　本实验观察到c-Jun在RAW264.7细胞核中即有基础表达，当受到LPS刺激后，RAW264.7细胞中c-Jun阳性细胞数明显增多，证实LPS刺激可以导致细胞核内c-Jun的高表达[9]。本研究所用三个浓度槐定碱对LPS诱导的c-Jun表达均有抑制效应，且其效应有剂量依赖性，高浓度(31.25 mg•L-1)效应强于中、低浓度，而本研究中三个浓度槐定碱本身对RAW264.7细胞c-Jun表达均无影响，说明槐定碱预处理抑制的是LPS诱导的c-Jun表达，与LPS信号转导通路有关，而对RAW264.7细胞的c-Jun基础表达无影响。
　　槐定碱预孵育细胞24h后给予LPS刺激，在本研究所设的四个时间点中，自5min起c-Jun阳性细胞数开始较同时间点LPS模型组减少，但无统计学意义，30min起各时间点均较同时间点LPS模型组显著减少，有统计学意义(均P<0.01)，但均未回复至Mφ对照组水平，说明槐定碱不能完全抑制LPS诱导的c-Jun表达，考虑可能与LPS刺激c-Jun表达的某些通路是槐定碱作用不涉及的有关。另外，槐定碱作用细胞后对LPS诱导的c-Jun表达的时间效应与LPS模型组不平行。LPS模型组随LPS作用时间延长，c-Jun阳性细胞数逐渐增高，持续升至120min;而槐定碱预处理组各时间点c-Jun阳性细胞数无明显变化，其时间效应曲线几乎呈一直线，但均一致性的显著高于同时间点Mφ对照组(P<0.05或 P<0.01)。由此更进一步说明，槐定碱抑制了部分诱导c-Jun表达的LPS转导通路，但仍有一些LPS刺激c-Jun表达的通路不能被槐定碱抑制。
　　本实验结果表明槐定碱可下调LPS所诱导的RAW264.7巨噬细胞c-Jun的高表达，并因此减少炎症因子表达，减轻内毒素所致炎症反应。但内毒素信号转导通路复杂，涉及环节众多，因此确定槐定碱抑制LPS诱导的c-Jun蛋白表达是作用于c-Jun 还是作用于其上游的某些通路，抑或是多靶点作用，尚须更进一步研究。
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