槲皮素对SGC7901胃癌细胞生长及HSP70和EGFR表达

　作者：向廷秀,陶小红,姜政,王丕龙,谯敏　　作者单位：重庆医科大学附属医院：实验研究中心;消化内科，重庆 400016

　　【摘要】目的观察槲皮素对胃癌细胞SGC7901生长及HSP70和EGFR的影响。方法 以台盼蓝拒染法计数胃癌细胞的生长抑制率，透射电镜从形态变化上了解凋亡的发生，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫组化检测HSP70和EGFR的表达。结果 台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制SGC7901细胞增殖的作用明显，且呈浓度和时间依赖性，槲皮素处理48h后的IC50为14.12μmol/L。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化，流式细胞仪检测表明经10-20μmol/L的槲皮素处理，SGC7901细胞周期阻滞于G0/G1期，经10μmol/L槲皮素处理的SGC7901下调HSP70和EGFR蛋白的表达。结论 槲皮素能抑制胃癌细胞的生长,呈时间剂量依赖性，能诱导SGC7901发生凋亡，使细胞周期阻滞于G0/G1期，抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调HSP70和EGFR的表达有关。

　　【关键词】 槲皮素,胃癌细胞,凋亡;HSP70;EGFR

　　ABSTRACT: ob[x]jective To investigate the effects of quercetin on human gastric cancer lines SGC7901 and on the ex[x]pression of heat shock protein 70 (HSP70) and epidermal growth factor receptor (EGFR). Methods The number of viable cells was ascertained by trypan blue dye exclusion test. Morphological changes of apoptotic cells were observed by electronic microscopy. Cell cycle was analyzed by flow cytometry. HSP70 and EGFR ex[x]pression was assayed by immunocytochemistry. Results Quercetin had a significant inhibition on the growth and proliferation of human gastric cancer line SGC7901 in vitro in a concentrationdependent manner. The IC50 was 14.12μmol/L after exposure to quercetin for 48h. Electronic microscopy provided evidence that apoptosis occurred in the gastric cancer cells of treatment groups. FCM analysis showed that quercetin arrested SGC7901 cells at the G0/G1 phase. The immunocytochemical study showed that the ex[x]pression of HSP70 and EGFR was significantly inhibited by 10μmol/L quercetin. Conclusion Dosedependent inhibitory effects of quercetin on the growth of human gastric cancer cell line are remarkable. Quercetin can induce apoptosis of SGC7901 and keep the cell cycle at G0/G1 phase from downregulating ex[x]pression of HSP70 and EGFR.

　　KEY WORDS: quercetin; gastric cancer cell; apoptosis; heat shock protein 70 (HSP70); epidermal growth factor receptor (EGFR)

　　肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常的疾病，同时也是凋亡异常的疾病。人们逐渐认识到肿瘤的生成是细胞增殖和凋亡平衡失调的结果。细胞周期失控导致细胞过度增殖，但更重要的是细胞凋亡受阻，直接导致了衰老、受损及异常细胞的生命延长。因此，通过诱导肿瘤细胞凋亡来消除肿瘤也是一种应该考虑的新的治疗方法。胃癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，预后差，生存率低，进展期胃癌5年存活率仅15%-25%[12]。槲皮素(quercetin)作为一种具有广泛生理作用的天然生物黄酮类化合物，广泛存在于蔬菜和水果中，具有抗感染、抗变态反应、扩血管和抑制血小板凝集等功能。近年来，槲皮素潜在的肿瘤预防和治疗作用日益受到关注。为了证实槲皮素的抗癌效应和探讨其作用机制，我们观察了槲皮素对胃癌细胞SGC7901生长及对热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)蛋白表达的影响，以揭示其抑制SGC7901生长的机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料 槲皮素为Sigma公司产品，将其用二甲基亚砜溶解(小于250g/L)后-20℃保存备用。用前加RPMI1640稀释至使用浓度。HSP70单抗和EGFR多抗购于中山生物工程公司。

　　1.2 细胞培养及处理 人胃癌细胞株SGC7901引种于重庆医科大学病理生理学教研室,培养于含10%(体积分数)小牛血清、100u/mL链霉素、100μg/mL青霉素和pH 7.2的PRMI1640液中，培养条件为37℃饱和湿度、体积分数为5% CO2孵箱中，1-3d换液一次，癌细胞为贴壁生长。取对数生长期细胞，调浓度为5×104个/mL，接种于培养瓶，进行试验。将槲皮素以5、10、20、40、80μmol/L的终浓度加入培养液中，同时设不加药的细胞培养液为对照组。

　　1.3 台盼蓝拒染试验 不同浓度槲皮素处理的细胞分别于24、48、72、96h经4g/L台盼蓝染液染色后用血球计数仪于光镜下计数，死细胞被染成蓝色，活细胞则不被染色，计数活细胞。

　　细胞抑制率(%)=[1-(实验组活细胞数/对照组活细胞数)]×

　　1.4 电子显微镜观察细胞凋亡情况 取对数生长期的胃癌细胞用1g/L的胰酶消化后调成1×106细胞浓度，PBS洗涤2遍，3%(体积分数)戊二醛固定4h，质量浓度为10g/L锇酸后固定1h，体积分数为50%、70%、90%、丙酮梯度脱水，618环氧树脂包埋，LKBNOVa切片，厚度500Nm，醋酸铀、枸橼酸铅双染色法染色，电镜下观察。

　　1.5 流式细胞仪观察细胞周期 以10μmol/L、20μmol/L的槲皮素处理细胞48h后，收集细胞制成单细胞悬液，PBS洗两次，制备的单细胞悬液，用70%(体积分数)冰乙醇固定。染色前用PBS进行离心沉淀，去除乙醇，加10g/L RNA酶的TrisHCl缓冲液(pH 7.4)120μL-200μL 37℃水浴30min，至4℃避光保存30min，再加入50μL碘化丙锭 (propidium iodide, PI)染色液混匀进行DNA染色，4℃避光30min。通过流式细胞仪FACScan测定细胞周期分布。设未处理的细胞为空白对照。

　　1.6 免疫组化检测HSP70和EGFR的表达 实验操作按SP试剂盒说明书进行，EGFR工作浓度为1∶100，HSP70为即用型工作液，用PBS代替一抗作空白对照。

　　1.7 统计学处理 计量资料采用两小样本均数t检验，完全随机设计资料方差分析，均采用SAS(stastical analysis system)6.12软件分析处理。以P<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2.1 不同浓度槲皮素对SGC7901细胞生长的作用 台盼蓝拒染计数结果显示不同浓度槲皮素对胃癌细胞增殖有抑制作用，呈时间、剂量依赖性，对SGC7901细胞的杀伤率均随着剂量的增大和作用时间的延长而增加，5μmol/L作用24h后对细胞的杀伤率与对照组比较有统计学意义(P<0.05，表1)。

　　表1 不同浓度的槲皮素对SGC7901细胞的抑制作用(略)

　　Table 1 Inhibitory effects of different quercetin concentration on human gastric cancer lines SGC7901

　　*P<0.01 vs. control; **P<0.05 vs. control; #P>0.05 vs. control

　　2.2 透射电镜观察细胞的凋亡情况 电镜下SGC7901细胞染色质丰富，核规则或不规则，核仁大，细胞器少，表面有短小微绒毛，具有典型的癌细胞特征。10μmol/L槲皮素处理细胞48h后，细胞表现凋亡细胞的特征性形态变化，细胞体积缩小、细胞表面微绒毛消失、胞浆肿胀、胞质中有空泡形成、细胞膜起泡、细胞核固缩、凋亡小体形成(图1)。

　　图1 透射电镜检测槲皮素处理后SGC7901细胞的凋亡情况(略)

　　Fig.1 Apoptosis of SGC7901 cells treated with quercetin detected by electronic microscopy (×6000)

　　2.3 槲皮素对胃癌细胞周期的影响 经不同浓度槲皮素处理48h后，SGC7901细胞的细胞周期变化明显，G0/G1期细胞从32.15%上升到57.31%，S期细胞轻微增加，而G2/M期细胞从45.57%下降到13.95%。说明槲皮素主要作用于细胞周期的G0-G1期(图2)。细胞增殖指数(PI)按下列公式计算。PI= (S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×

　　2.4 HSP70和EGFR的表达 HSP70[3]胞核或胞质着色、EGFR胞浆着色为阳性，SGC7901细胞中HSP70、EGFR为强阳性，以棕褐色为主。10μmol/L槲皮素作用48h后，采用HSCORE评分[4]，HSP70和EGFR的表达明显降低(表2、图3)。

　　表2 Hsp70和EGFR在胃癌细胞SGC7901中表达的HSCORE评分(略)

　　Table 2 HSCORE of HSP70 and EGFR ex[x]pression by SGC7901 cell lines

　　图2 槲皮素对SGC7901细胞周期的影响(略)

　　Fig.2 Cell cycle of SGC7901 cells treated with quercetin

　　A: cell cycle of SGC7901; B: cell cycle of SGC7901 cell treated with 10μmol/L quercetin; C: cell cycle of SGC7901 cell treated with 20μmol/L quercetin

　　图3 Hsp70和EGFR在胃癌细胞SGC7901与槲皮素处理组中表达的比较(略)

　　Fig.3 ex[x]pression of Hsp70 and EGFR in SGC7901 and quercetin group (10×20)

　　A: ex[x]pression of HSP70 in SGC7901; B: ex[x]pression of HSP70 in 10μmol/L quercetin group; C: ex[x]pression of EGFR in SGC7901; D: ex[x]pression of EGFR in 10μmol/L quercetin group

　　3 讨论

　　研究表明HSP70在恶性肿瘤细胞中常高表达，对肿瘤细胞的生长具有保护作用，与肿瘤的发生发展和预后有密切的关系[5]。热休克蛋白(heat shock protein, HSPs)通过下调凋亡相关基因、蛋白和蛋白酶活性而增强肿瘤细胞抗凋亡的能力，使细胞的生长抑制效应和死亡效应减弱[6]。此外，HSPs促进胃癌细胞的增殖，随着胃黏膜病变的演进、恶性转化程度的提高，增殖指数不断上升，凋亡细胞比例逐渐下降，细胞积聚速度明显增加，使细胞生长加快并表现出恶性行为。过度表达的HSPs还可使细胞获得对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)及单核细胞杀伤的耐受,有助于肿瘤免疫逃逸[7]。如何调节HSPs的表达，使癌细胞不能维持正常代谢，应急能力下降，抑制增殖已成为治疗肿瘤的一个新的途径。

　　EGFR广泛存在于哺乳动物的细胞膜上，是一种跨膜糖基化磷酸蛋白，分子量170ku，其膜内部分一级结构与erbB癌基因产物P68erbB十分相似，被认为是原癌基因cerbB1的表达产物，具有酪氨酸酶活性，能被激活而产生磷酸化，使许多底物蛋白磷酸化，提供持续分裂信号到细胞内，在细胞的恶性转化和增殖中起重要作用。Murphy等[8]研究表明EGFR可通过自分泌途径促进细胞有丝分裂和癌细胞的增殖。国内外许多学者研究表明，EGFR在正常胃黏膜组织中无表达或表达较弱，在大部分不典型增生的慢性胃炎和胃癌中，EGFR和它的配体(EGF、TGFα等)常过表达61%-66%，明显高于其他肿瘤[911]。EGFR能特异性地和EGF结合，控制细胞的代谢、生长和癌变，与胃癌生长及发展密切相关。

　　近年来证实槲皮素有较广的抗瘤谱，对多种肿瘤细胞株及移植瘤有较高的抑制率。例如：对乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、皮肤癌、胰腺癌、食管癌等均具有抑制作用[1216]，但其抑癌机制众说纷纭。由于HSP70、EGFR与肿瘤生长及发展的密切关系，本实验揭示：①槲皮素可使胃癌细胞S期及G2/M期细胞所占比例减少，阻断了G0/G1期细胞向S期及G2/M期移行过渡，出现G0/G1期细胞堆积增多的现象，从而抑制胃癌细胞的生长，诱导细胞凋亡，增殖指数(PI)随槲皮素浓度增加而下降，由67.85%下降为42.69%;②槲皮素具有下调癌细胞HSP70和EGFR的表达、诱导胃癌细胞凋亡的作用，且细胞凋亡与槲皮素呈一定的剂量效应关系。提示HSP70和EGFR可能是槲皮素的作用靶点。